Конкурс научных работ 2018 года

Самые маленькие частицы в крови
сдают позиции под натиском
технологии сканирующей проточной цитометрии

В.П.Мальцев, Д.Н.Чернова, А.И.Конохова, А.Л.Литвиненко, М.А.Юркин, А.Е.Москаленский, В.М.Некрасов, А.В.Чернышев. Д.И.Строкотов, Н.А.Кармадонова¹, А.А.Карпенко¹, Е.А.Покушалов¹, О.А.Новикова¹, А.Р.Мулюков²

¹ НМИЦ им. Мешалкина,
² НГУ

1. Общая формулировка научной проблемы и ее актуальность.

Самые маленькие по размерам популяции биочастиц в крови человека – хиломикроны, микровезикулы и тромбоциты – играют существенную роль в таком важном процессе, как гемостаз, а также роль информационных трансляторов в сигнальной системе иммунных реакций и энергетических транспортеров. Сложность решения проблемы определения характеристик, например, тромбоцитов заключается в высокой нестабильности последних. При любом воздействии вне кровяных сосудов, тромбоциты активируются с изменением своих статических и динамических характеристик. Большая полидисперсность и малые размеры хиломикронов и микровизикул не позволяла надежно исследовать свойства этих двух популяций существующими методами. Представленный цикл работ является важным этапом на пути к созданию методического обеспечения для характеризации гемостаза пациентов и исследования динамики элиминации хиломикронов в крови.

2. Конкретная решаемая в работе задача и ее значение.

Создание адекватного математического описания формы тромбоцита – это первый этап в линейке задач характеризации клеток по статическим и динамическим индексам. Ранее тромбоцит описывался оптической моделью гомогенного сплюснутого сфероида, что обеспечивало определение характеристик клеток по светорассеянию с приемлемой точностью только для красного диапазона длин волн (600-700 нм.). Коротковолновая область имеет большую чувствительность к характеристикам клетки и модель сфероида не позволяет определять эти характеристики из-за больших различий в теоретических и экспериментальных индикатрисах светорассеяния. Для повышения точности измерения характеристик тромбоцита по светорассеянию необходимо перейти к использованию коротковолнового излучения, однако для такого перехода необходимо отказаться от упрощенной оптической модели тромбоцита, задаваемой сплюснутым сфероидом.

Повышение точности определения характеристик тромбоцитов напрямую влияет на точность решения обратной задачи биокинетики при исследовании процесса их активации. Активация тромбоцитов является первым процессом, который запускается при гемостазе. Во время активации происходит изменение формы тромбоцита. К моменту проведения исследований не существовало методов измерения формы тромбоцита с высокой точностью, что не позволяло измерять функции распределения по степени активации различных клеток. Измерение степени активации тромбоцитов необходимо для создания адекватной молекулярно-кинетической модели активации и ее экспериментальной проверки.

Многочисленные попытки разделить микрочастицы крови по фракциям с использованием стандартного подхода в проточной цитометрии не приводили к решению проблемы. Необходимо было провести теоретический анализ возможности метода двухуглового рассеяния в исследовании свойств частиц с размерами сравнимыми с длиной волны. Определить диапазоны размеров и показателей преломлений, где характеристики частицы могут однозначно восстанавливаться этим методом. На основании проведенной расчетов необходимо предложить теоретически обоснованный метод, который позволит разделить различные фракции микрочастиц в крови и характеризовать их. Исследование динамики элиминации одной из фракций, хиломикронов, позволит объяснить влияние этих частиц на развитие такого заболевания, как атеросклероз.

3. Используемый подход, его новизна и оригинальность.

В решении всех задач цикла работ использовались уникальные инструментальные возможности оригинальной технологии – сканирующей проточной цитометрии в измерении оптических свойств элементов дисперсной фазы, тромбоцитов и микрочастиц крови человека, в режиме поштучного анализа. Предложена оригинальная формула для описания формы тромбоцита в при различных состояниях активации. Для решения прямой задачи светорассеяния на тромбоцитах использовался оригинальный вычислительный пакет ADDA. Для определения статических характеристик тромбоцитов в различных активированных состояниях были разработаны новые методы решения обратной задачи светорассеяния. Все методы, используемые при определении характеристик клеток, являются оригинальными и обладают фундаментальной новизной.

4. Полученные результаты и их значимость.

В ходе исследований была предложена новая математическая формула для описания формы активированного тромбоцита. Заложен фундамент в повышении точности определения характеристик тромбоцитов при активации за счет создания принципиально новой оптической модели активированного тромбоцита с учетом биохимических и физических внутриклеточных процессов. Получено практически идеальное согласие формы тромбоцита в различных активированных состояниях с микроскопическими исследованиями.

Решена задача первого этапа в изучении гемостаза: характеризация тромбоцитов в различных состояниях при активации. Для длинноволновой области спектра разработано методическое обеспечение, которое позволяет определять форму тромбоцита в различных активированных состояниях. В частности, все три известные фракции тромбоцитов – не активированная, частично активированная и полностью активированная – уверенно выделялись с использованием предложенной методики. Для определения процентного отношения по фракциям и средних фракционных значений была предложена характеристика тромбоцита – индекс формы. Построенные распределения по индексу формы позволили измерить дополнительные 8 параметров для тромбоцитов. Самые современные анализаторы определяют только 3 параметра для этих клеток.

Для микрочастиц крови проведен полный анализ их светорассеивающих свойств, разбор возможностей имеющихся оптических методов их анализа, предложен оптимальный путь решения проблемы характеризации хиломикронов в присутствии микровизикул. Впервые исследована элиминация хиломикронов при различных физиологических процессах. Установлено, что проблемы в элиминации являются индикатором риска развития атеросклероза.

5. Уровень полученных результатов в сравнении с мировым.

Разработанные методы обладают мировой новизной в инструментальном, теоретическом и экспериментальном планах при статической и динамической характеризации клеток крови человека. Достигнуты рекордные результаты по полноте характеризации частиц в крови с наименьшими размерами. Результаты докладывались на ведущих международных конференциях. Работа поддерживается тремя грантами РНФ.

6. Вклад авторского коллектива.

Вклад авторского коллектива из ИХКГ является определяющим. Вклад сотрудников НМИЦ им Мешалкина состоял в предоставлении клеточного материала с информацией о состоянии здоровья доноров крови.

Список публикаций.

Konokhova A.I. et al. Light-scattering gating and characterization of plasma microparticles // J. Biomed. Opt. 2016. Vol. 21, № 11. P. 115003–115003.
Litvinenko A. l. et al. Fluorescence-free flow cytometry for measurement of shape index distribution of resting, partially activated, and fully activated platelets // Cytometry. 2016. Vol. 89, № 11. P. 1010–1016.
Chernova D.N. et al. Chylomicrons against light scattering: The battle for characterization // Journal of Biophotonics. 2018. P. e201700381.
Moskalensky A.E. et al. Method for the simulation of blood platelet shape and its evolution during activation // PLOS Computational Biology. 2018. Vol. 14, № 3. P. e1005899.

Информационное приложение

1. Konokhova A.I. et al. Light-scattering gating and characterization of plasma microparticles // J. Biomed. Opt. 2016. Vol. 21, № 11. P. 115003–115003.

5-IF^* 2.61 OPTICS^** 2.76 (0.644^***) Σ 5.37

2. Litvinenko A. l. et al. Fluorescence-free flow cytometry for measurement of shape index distribution of resting, partially activated, and fully activated platelets // Cytometry. 2016. Vol. 89, № 11. P. 1010–1016.

5-IF 3.34 BIOCHEMICAL RESEARCH METHODS 2.82 (0.651) Σ 6.16

3. Chernova D.N. et al. Chylomicrons against light scattering: The battle for characterization // Journal of Biophotonics. 2018. P. e201700381.

5-IF 3.69 OPTICS 7.83 (0.878) Σ 11.52

4. Moskalensky A.E. et al. Method for the simulation of blood platelet shape and its evolution during activation // PLOS Computational Biology. 2018. Vol. 14, № 3. P. e1005899.

5-IF 4.83 MATHEMATICAL & COMPUTATIONAL BIOLOGY 11.80 (0.924) Σ 16.63

Σ 39.68

^* журнальный критерий. Импакт-фактор журнала за последние 5 лет.

^** категориальный критерий. Отношение общего количества журналов в данной категории к позиции, занимаемой конкретным журналом.

Примечание.

Журнальный и категориальный критерии можно взять в базе WoS, нажав на поле «Journal Citation Reports».
Если публикация не представлена в WoS, то журнальный критерии принимается равным 0.25, а категориальный – 1 (единица).

^***В WoS вычисляется процентиль в качестве категориального фактора. Процентиль=(Общее количество журналов – позиция журнала + 0.5 шага между соседними значениями)/Общее количество журналов. Шаг между соседними значениями в данном случае = 1.

Т.е. если журнал занимает 7 место из 36, то процентиль = (36-7+0.5)/36=0.819.

Процентиль > 0.75, следовательно журнал в Q1 и т.д.