Кинетика реакционно-анизотропных частиц в гетерогенных биосистемах: теория и эксперимент по лиганд-рецепторному связыванию в процессах иммуноагглютинации, клеточной рецепции и апоптоза

А.В. Чернышев, И.В. Хало, В.М. Некрасов, М.А. Юркин, Д.И. Строкотов,

А.И. Конохова, В.П. Мальцев,

А.А. Карпенко¹, В.С. Козырева¹, А.Н. Шилова¹, Г.Е. Яковлева², В.С. Заковряшин²,

Р.В. Вахрушев³, D.Y. Orlova⁴, E. Bartova⁵, S. Kozubek⁵

¹Сибирский федеральный биомедицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина, Речкуновская 15, Новосибирск 630055.

²АО “Вектор-Бест”, р.п. Кольцово 630559, Новосибирская область.

³Институт ядерной физики имени Г.И.Будкера, пр. академика Лаврентьева 11, Новосибирск 630090.

⁴Department of Genetics, Stanford University School of Medicine, 279 Campus Drive, 94305 Stanford, CA, USA.

⁵Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Kralovopolska 135, Brno CZ-612 65, Czech Republic.

1. Общая формулировка научной проблемы и ее актуальность

В кинетических задачах химии и биологии обычно рассматривается реакция ассоциации двух частиц (молекул, комплексов, агрегатов, биологических клеток, и др.), у которых реакционно-активной является лишь часть их поверхности, называемая часто «активным пятном» или «сайтом связывания», а сами частицы называются реакционно-анизотропными. К таким задачам относятся, в частности: обычные реакции с участием радикалов, клеточная рецепция, ферментативный катализ, мембранный транспорт, иммуноагглютинация, и пр. Однако, до настоящего времени кинетика взаимодействия реакционно-анизотропных частиц далека от полного понимания. Современное традиционное («классическое») рассмотрение таких процессов в области биокинетики не учитывает особенность гетерогенных биосистем – а именно дискретность сайтов связывания (то есть малость размера сайта связывания по сравнению с расстоянием между сайтами) и широкое (и обычно неизвестное) пространственное распределение этих сайтов. В результате, анализ полученных экспериментальных данные с позиции «классической» теории оказывается неэффективным, что часто приводит к ошибочной интерпретации и тормозит развитие как теоретического моделирования, так и экспериментального исследования в самых разных областях химии, биологии, биотехнологии, медицины.

2. Конкретная решаемая в работе задача и ее значение

В данной работе была поставлена задача экспериментально обосновать и развить кинетическую теорию реакционно-анизотропных процессов в гетерогенных биосистемах в рамках диффузионного (Броуновского) лимитирования скорости реакции частиц с несколькими малыми (дискретными) активными пятнами применительно к следующим трем системам: 1) иммуноагглютинация латексных наночастиц, 2) конденсация внутриядерного хроматина на начальной стадии апоптоза клетки, 3) клеточная рецепция лейкоцитов крови человека. В этих системах была показана неприменимость общепринятого «классического» (недискретного) подхода.

3. Используемый подход, его новизна и оригинальность

В теории использовались дифференциальные кинетические уравнения диффузионно-контролируемых реакций частиц с анизотропной реакционной способностью, которое хорошо себя зарекомендовало в других задачах химической кинетики, но впервые примененные в биокинетике позволило получить новые интересные результаты в данной работе. Эксперименты по кинетике лиганд-рецепторного связывания в гетерогенных биосистемах (коллоидных латексных иммуносистемах, популяциях лейкоцитов крови, одиночных культуральных клеток) проводились с использованием трех экспериментальных методов: динамической турбидиметрии, проточного цитофлуориметра и сканирующего конфокального микроскопа. Обработка экспериментальным данных проводилась оригинальным методом анализа динамики клеточного распределения (в принципе произвольного, в силу специфики гетерогенных биосистем).

4. Полученные результаты и их значимость

Предложен новый аналитический подход в динамической турбидиметрии латексной иммуноагглютинации, позволяющий проводить количественный анализ без использования калибровочных частиц. Предсказана (дискретной теорией) и экспериментально зарегистрирована «неклассическая» динамика агрегации в условиях малого (<10) количества комплементарных сайтов связывания на частицах (из-за малого размера частиц или низкой концентрации растворенных антител).

Разработана и экспериментально обоснована оригинальная молекулярно-кинетическая модель появления и роста периферической оболочки конденсированного хроматина в ядре апоптирующей клетки на основе аналитического решения нестационарного реакционно-диффузионного уравнения с движущейся границей (задача Стефана) в условиях лиганд-рецепторного связывания одновременно двух типов – специфического и неспецифического. Теоретически и экспериментально показано, что граница конденсированного хроматина в апоптирующем ядре движется пропорционально квадратному корню от времени.

В проточной цитометрии предложен новый метод определения количества рецепторов на поверхности частиц (клеток), используя нелинейность кинетических уравнений лиганд-рецепторного взаимодействия в условиях небольшого отличия концентраций лигандов и рецепторов. Теоретически объяснено и экспериментально продемонстрировано «неклассическое» следствие дискретной теории - скорость ассоциации растворенных молекул лиганда с поверхностными рецепторами «макрочастиц» (клеток) не зависит от размера этих «макрочастиц».

5. Уровень полученных результатов в сравнении с мировым

Развиваемые авторами теоретические и экспериментальные методы соответствуют современному уровню развития науки в данной области. Данная работа поддерживалась российскими грантами РФФИ (16-04-01283, 16-34-00300) и РНФ (14-15-00155, 17-75-20117), а также грантом Czech Science Foundation (grant P302-12-G157). Результаты работы обладают мировой новизной и докладывались авторами на научных семинарах ИХКГ СО РАН и международных конференциях:

1)  A.A. Polshchitsin, V.M. Nekrasov, A.V. Chernyshev. “Turbidimetric study of protein-coated particles agglutination” // Electromagnetic and Light Scattering XIV, June 17-21, 2013, Lille, France, p. 120.

2)  A.I. Konokhova, A.V. Chernyshev, D.Y. Orlova, M.A. Yurkin, I.V. Khalo, V.P. Maltsev. “Nuclear apoptotic volume decrease in individual cells: time-lapse confocal microscopy imaging and molecular-kinetic modeling” // CYTO 2015 – 30th Congress of ISAC, Glasgow, United Kingdom, June 26-30, 2015, p. 118.

3)  K.V. Trusov, A.V. Chernyshev, A.I. Konokhova, M.A. Yurkin, I.V. Khalo, V.P. Maltsev. “Nuclear apoptotic volume decrease in individual cells: Confocal microscopy imaging and kinetic modeling” // CYTO 2018, 33rd Congress of ISAC, April 28 - May 2, 2018, Prague, Czech Republic, p. 244.

4)  D. Patlai, I.V. Khalo, V. Kozyreva, R. Vakhrushev, V.P. Maltsev, A.V. Chernyshev. “Determination of CD14 receptors number on the surface of mononuclear cells without use of calibration microbeads by flow cytometry” // CYTO 2018, 33rd Congress of ISAC, April 28 - May 2, 2018, Prague, Czech Republic, p. 122.

6. Вклад авторского коллектива

Данная работа была выполнена в сотрудничестве научных коллективов нескольких институтов. Авторский коллектив ИХКГ СО РАН внес основной вклад в постановку задачи и ее решения теоретическими и экспериментальными методами.

Список статей в рецензируемых изданиях:

1. Alexey A. Polshchitsin, Vyacheslav M. Nekrasov, Valentin S. Zakovryashin, Galina E. Yakovleva, Valeri P. Maltsev, Maxim A. Yurkin, Andrei V. Chernyshev. Kinetic turbidimetry of patchy colloids aggregation: latex particles immunoagglutination. Colloids and Surfaces A., v. 516, pp. 72–79, 2017.

2. Irina V. Khalo, Anastasiya I. Konokhova, Darya Y. Orlova, Konstantin V. Trusov, Maxim A. Yurkin, Eva Bartova, Stanislav Kozubek, Valeri P. Maltsev, Andrei V. Chernyshev. Nuclear apoptotic volume decrease in individual cells: confocal microscopy imaging and kinetic modeling. Journal of Theoretical Biology, v. 454, pp. 60-69, 2018.

3. Irina V. Khalo, Viktoriya S. Kozyreva, Roman V. Vakhrushev, Daria S. Patlai, Anna N. Shilova, Andrei A. Karpenko, Maxim A. Yurkin, Alexander E. Moskalensky, Dmitry I. Strokotov, Valeri P. Maltsev, Andrei V. Chernyshev. Calibration-free quantitative immunoassay by flow cytometry: Theoretical consideration and practical implementation for IgG antibody binding to CD14 receptors on human leukocytes. Cytometry Part A, v. 93, pp. 695-705, 2018.