Разработка методик исследования форм одиночных тромбоцитов и их субпопуляций.
Литвиненко Алёна Леонидовна,
аспирант 3-го года обучения ФФ НГУ, младший научный сотрудник
Лаборатория Цитометрии и Биокинетики, науч. рук.: к.ф.-м.н. В.М. Некрасов
1. Общая формулировка научной проблемы и ее актуальность
Тромбоциты – клетки крови основной функцией которых является участие в поддержание гемостаза. В последние годы всё чаще появляются данные, свидетельствующие о влиянии тромбоцитов на другие системы организма, в частности о участии тромбоцитов в иммунном ответе. Также согласно клеточной модели гемостаза, каскад реакций, приводящий к появлению тромба в кровотоке проходит на поверхности тромбоцитов одновременно с изменение формы данных клеток. Помимо этого, тромбоциты играют ключевую роль в адгезии тромба к стенки сосуда на начальных этапах свёртывания крови, благодаря взаимодействию с факторами фон Виллебранда. Нарушения в работе тромбоцитов могут сказываться на нормальном протекании всех вышеперечисленных процессов.
Активация тромбоцитов является нормальной реакцией на нарушение целостности сосуда. Данный процессы сопровождается быстрым изменением формы (в зависимости от агониста активации время изменения формы может быть от 1-3 до 30 секунд), появлением специфических рецепторов, образования псевдоподий и выпуском гранул. Причём изменение формы является самой первой реакцией на появление агониста активации. Именно поэтому исследование активации тромбоцитов, наблюдая за изменением формы является актуальным.
На сегодняшний день не существует быстрой и простой методики получения информации о форме отдельных тромбоцитов. Все существующие методики требуют сложной подготовки пробы (зачастую с использованием флюорисцентных меток), а также дают информацию в основном о единичных клетках, что может быть не достаточным для оценки популяции тромбоцитов в целом.
2. Конкретная решаемая в работе задача и ее значение
Цикл работ посвящён исследованию формы тромбоцитов, как одиночных, так и популяции в целом. В качестве задач можно выделить следующие пункты: разобраться в процессах, приводящих к изменению формы тромбоцита, создать модель формы тромбоцита, основанную на современных знания о процессах, приводящих к изменению формы и разработать методику измерения и описания популяции нативных тромбоцитов.
3. Используемый подход, его новизна и оригинальность
Для выполнения первой поставленной задачи был подготовлен обзор литературы по теме. Для решения второй задачи было проведено моделирование основного элемента тромбоцита, поддерживающего форму – периферического кольца микротрубочек. Мембрана моделировалась, как поверхность минимальной площади, натянутая на кольцо микротрубочек и вмещающая в себя определённый объём клетки. Для измерения формы большого количества тромбоцитов использовался сканирующий проточный цитометр для получения сигналов светорассеяния и решение обратной задачи светорассеяния методом баз данных для идентификации параметров формы конкретного рассеивающего тромбоцита. В качестве модели формы для расчёта базы данных использовался сплюснутый сфероид, так как он отвечает условию осесимметричной в отличие от новой модели.
4. Полученные результаты, их уровень и значимость
В результате данного цикла работ систематизирована информация о ключевых процессах происходящих внутри тромбоцита в процессе активации. Благодаря этому удалось выделить ключевые события, приводящие именно к изменению формы из огромного множества параллельно протекающих процессов. Также была выдвинута гипотеза о роли изменения формы тромбоцитов в адгезии к стенкам сосудов. Согласно данной гипотезе активированные тромбоциты ближе подходят к стенке сосуда в условиях потока за счёт потери плоской формы.
Пользуясь знаниями о динамике ключевого элемента тромбоцита, отвечающего за сплюснутую форму, кольца микротрубочек удалось построить модель формы. Данная модель включает более широкий класс форм и имеет более корректное обоснование с точки зрения биологии по сравнению с распространённой моделью сплюснутого сфероида. Но не является осесимметричной, что усложняет её использование для решения обратной задачи светорассеяния. Данная модель реализована в качестве скрипта для программы Surface Evolver.
Также были проведены ряд экспериментов по определению формы одиночных тромбоцитов высокой статистикой. В результате были получены распределения по индексу формы и объёму более, чем для 15 доноров и разработана теоритическая модель описания популяции тромбоцитов. Используя данную модель всю популяцию нативных тромбоцитов можно разделить на 3 субпопуляции: неактивированные, частично активированные и полностью активированные тромбоциты. Также было показано, что с добавлением активатора доля полностью активированных тромбоцитов растёт, что согласуется с общеизвестными фактами.
Все полученные результаты важны для понимания процессов, приводящих к изменению формы тромбоцитов в процессе активации. Также методика измерения сигнала светорассеяния от тромбоцитов позволяет получить достаточную статистику при условие малого влияния в процессе подготовки пробы. А деления на фракции позволяет точнее описывать состояние популяции нативных тромбоцитов.
5. Вклад молодого ученого в выставляемые на конкурс работы
Наибольший вклад был внесён в третью работу. Все эксперименты, обработка экспериментальных данных и иллюстрации были выполнены участником конкурса, помимо работы над текстом. В первой и второй работе конкурсант участвовал в подбое литературы, написании текста, а также разработке ключевых гипотез статей.
6. Список статей, опубликованных в рецензируемых журналах, индексируемых ISI
1. Moskalensky A.E., Litvinenko A.L. The platelet shape change: biophysical basis and physiological consequences // Platelets. 2018. Т. 0. № 0. С. 1–6. 10.1080/09537104.2018.1514109
2. Moskalensky AE, Yurkin MA, Muliukov AR, Litvinenko AL, Nekrasov VM, Chernyshev AV, Maltsev VP. Method for the simulation of blood platelet shape and its evolution during activation. PLOS Computational Biology 2018; 14: e1005899. DOI:10.1371/journal.pcbi.1005899
3. Litvinenko A.L. и др. Fluorescence-free flow cytometry for measurement of shape index distribution of resting, partially activated, and fully activated platelets // Cytometry Part A. 2016. Т. 89. № 11. С. 1010–1016. DOI: 10.1002/cyto.a.23003